ایران ترجمه – مرجع مقالات ترجمه شده دانشگاهی ایران

مدل آزمایشگاهی استخوان عروقی: هم افزایی رشد عروقی و تشکیل استخوان

مدل آزمایشگاهی استخوان عروقی: هم افزایی رشد عروقی و تشکیل استخوان

مدل آزمایشگاهی استخوان عروقی: هم افزایی رشد عروقی و تشکیل استخوان – ایران ترجمه – Irantarjomeh

 

مقالات ترجمه شده آماده گروه پزشکی

مقالات ترجمه شده آماده کل گروه های دانشگاهی

مقالات رایگان

مطالعه ۲۰ الی ۱۰۰% رایگان مقالات ترجمه شده

۱- قابلیت مطالعه رایگان ۲۰ الی ۱۰۰ درصدی مقالات ۲- قابلیت سفارش فایل های این ترجمه با قیمتی مناسب مشتمل بر ۳ فایل: pdf انگیسی و فارسی مقاله همراه با msword فارسی -- تذکر: برای استفاده گسترده تر کاربران گرامی از مقالات آماده ترجمه شده، قیمت خرید این مقالات بسیار کمتر از قیمت سفارش ترجمه می باشد.  

چگونگی سفارش

الف – پرداخت وجه بحساب وب سایت ایران ترجمه (شماره حساب) ب- اطلاع جزئیات به ایمیل irantarjomeh@gmail.com شامل: مبلغ پرداختی – شماره فیش / ارجاع و تاریخ پرداخت – مقاله مورد نظر -- مقالات آماده سفارش داده شده عرفا در زمان اندک یا حداکثر ظرف مدت چند ساعت به ایمیل شما ارسال خواهند شد. در صورت نیاز فوری از طریق اس ام اس اطلاع دهید.
مقالات ترجمه شده پزشکی - ایران ترجمه - Irantarjomeh
شماره
۳۷
کد مقاله
MDSN37
مترجم
گروه مترجمین ایران ترجمه – irantarjomeh
نام فارسی
مدل آزمایشگاهی استخوان عروقی:  هم افزایی رشد عروقی و تشکیل استخوان
نام انگلیسی
In Vitro Model of Vascularized Bone: Synergizing Vascular Development and Osteogenesis
تعداد صفحه به فارسی
۴۰
تعداد صفحه به انگلیسی
۹
کلمات کلیدی به فارسی
مدل آزمایشگاهی، استخوان عروقی،
 هم افزایی، رشد عروقی، تشکیل استخوان
کلمات کلیدی به انگلیسی
In Vitro Model , Vascularized Bone, Synergizing,Vascular Development, Osteogenesis
مرجع به فارسی
دپارتمان مهندسی بیوپزشکی، دانشگاه های کلمبیا، بالتیمور، یل، ایالات متحده
گروه تحقیقاتی بیومواد، زیست تجزیه پذیر، زیست تقلیدی، دانشگاه مینهو، پرتقال
مرجع به انگلیسی
Department of Biomedical Engineering, Columbia University, New York, New York, United States of America, Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins
University, Baltimore, Maryland, United States of America, Department of Biomedical Engineering, Yale University, New Haven, Connecticut, United States of America
۴ ۳B’s Research Group – Biomaterials, Biodegradables and Biomimetics, University of Minho, Guimara˜es, Portugal
قیمت به تومان
۱۵۰۰۰
سال
۲۰۱۱
کشور
ایالات متحده – پرتقال

 

 
مدل آزمایشگاهی استخوان عروقی:  هم افزایی رشد عروقی و تشکیل استخوان
 دپارتمان مهندسی بیوپزشکی، دانشگاه های کلمبیا، بالتیمور، یل، ایالات متحده
گروه تحقیقاتی بیومواد، زیست تجزیه پذیر، زیست تقلیدی، دانشگاه مینهو، پرتقال
PLoS ONE | www.plosone.org
۲۰۱۱
 
 چکیده
مهندسی بافت فراهم آورنده فرصت های منحصر بفردی برای تولید مجدد بافت های آسیب دیده یا  بافت های معیوب با استفاده از سلولهای به دست آمده از بیوپسیهای بافتی را فراهم می آورد. پیوندهای مهندسی بافت را نیز همچنین می توان به عنوان مدل های کاملا مطلوب جهت بررسی تعاملات سطح سلولی و مولکولی در زمینه فرایندهای رشد مورد استفاده قرار داد. در این مطالعه، ما اقدام به هم کشتی سلولهای اندوتلیال وریدی نافی انسانی (HUVECs) و سلولهای پایه مزون شیمی انسان (MSCs) تحت شرایط محیطی مختلف اقدام می نماییم تا آنکه تعاملات هم نیروزادی که منجر به رشد هم بیانی بافت های مویرگ مانند و استخوان مانند را مورد بررسی قرار دهیم. سلول ها به نسبت ۱:۱ در ژل فیبرین کپسوله   می گردند تا آنکه قابلیت پالایش و بررسی ترکیبات رسانه رشد اندوتلیال (EGM) و رسانه رشد استخوان (OM) وجود داشته باشد. این موضوع مشخص گردید که جهت تشکیل هر دوی بافت ها، امر همکشتی    می بایست در ابتدا دارای EGM باشد و در پی آن میزان ۱:۱ از ترکیب دو نوع رسانه حاوی پروتئین-۲ ریخت ساز استخوانی باشد. مطالعات بعدی HUVECs و MSCs رشد داده شده در اسکفولتها یا  داربست های استخوانی میله ای شکل سلول زدایی شده برای ۶ هفته مشخص کننده تاثیرات ساختار بافت هر دوی گوناگونی های موقتی در زمینه موجودیت عامل رشد و اضافه شدن سلول های تازه می باشد. پیوندهای حاصله در زیر پوست یک موش ایمپلند یا کشت گردید تا آنکه ثبات فنوتیپ یا شکل ظاهری و عملکرد رگهای مهندسی شده مشخص گردد. دو یافته مهم بواسطه این مطالعات پدیدار گردیدند: (۱) رشد عروقی می بایست قبل از پیدایش استخوان حاصل گردد و (۲) اضافه نمودن hMSCs  بیشتر در مرحله القای رشد استخوان سبب ارتقای هر دوی نتایج بافتی خواهد شد، همان گونه که بوسیله کسر حجمی افزایشی استخوان، رسوب استخوانی، مجاورت نزدیک پروتئین های استخوان به شبکه های عروقی و هم دهان گردی یا به هم پیوستن و پیوند شبکه های عروقی با سیستم عروقی میزبان مشاهده شده است.  به طور قابل توجه، این مشاهدات به خوبی با آنچه که برای رشد موضعی یا محلی تشریح شده است مقایسه گردید. ما پیشنهاد می نماییم که سیستم کشت ما قابلیت تقلید ویژگی های مختلف سلول اندوتلیال- برهمکنش های پیش ماده مرتبط با تشکیل استخوان تحت شرایط طبیعی، را خواهد داشت و همچنین    می تواند کارای قابل توجهی به عنوان یک مدل برای مطالعات بر همکنش های سلولی هیدروتیپیک که در تعامل با تشکیل رگهای خونی در مبحث پیدایش استخوان دارد را بیابد.
مقدمه
در استخوان طبیعی، برهمکنش های هم افزایی بین استئوبلاستها یا یاخته های استخوان ساز/ پیش ماده های استئوژنیک یا مرتبط با تشکیل استخوان و سلولهای اندوتلیال سبب رشد هماهنگ بافت سیستم عروقی و بافت مینرالیزه می گردد. در فرایند تشکیل استخوان داخل غشایی در طی رشد استخوان کرانیوفاسیال، این جفت شدگی سلولی منجر به ارتباطات فضایی نزدیکی بین دو بافت در استخوان شکل یافته جدید می گردد، که در آن شبکه عروقی به عنوان یک قالب برای ته نشست شدگی کانی استخوان عمل می نماید. یک هم افزایی بین دو جمعیت سلولی در طی تشکیل استخوان اندوکندرال مشاهده شده است. یک مدل موش مانند جهت نشان دادن این موضوع به کار گرفته شد که به هنگامی که پروتئینHIF-1a  به صورت حداکثری اقدام به فعال سازی استوبلاست ها از طریق تهی سازی یا حذف شرطی ژن Vhl   می نماید، نتیجه حالت بالاتر عروقی در استخوان های دراز با افزایش تکمیلی در حجم استخوان می باشد. در مطالعه اخیر، این موضوع نشان داده شد که پیش ماده های استئوبلاست به هنگام اشغال قالب غضروفی در امتداد رگهای خونی اقدام به اشغال موقعیت های پریستیک می نمایند تا آنکه قابلیت تشکیل استخوان جدید میله میله مانند در طی فاز تشکیل استخوان های بزرگ را داشته باشند. با این حال، بسیاری از مکانیزم های برهم کنش های راهنما بین سلولهای اندوتلیال و پیش ماده های استوژنیک به میزان زیادی به واسطه پیچیدگی محیط طبیعی همچنان ناشناخته باقی مانده اند.
مواد و روش ها
مواد
سرم جنینی شبه گاوی (FBS)، روش کشت Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)، پنسیلین – آنتی بیوتیکی (Pen–StrepHEPES و تریپسین/ EDTA از Invitrogen (Carlsbad, CA) حاصل آمد. از کوربیک اسید- ۲- فسفات، دکسامتازون، سدیم- b– گلیسروفسفات، تریون X-100، فیبرونوژن و ترومبین از Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) حاصل شد. عامل رشد اولیه فیبربلاست (bFGF) و پروتئین ۲ ریخت زای استخوانی (BMP2) نیز از Peprotech (Rocky Hill, NJ) به دست آمد. رسانه -۲ رشد اندوتلیال (EGM) نیز از Lonza (Walkersville, MD) حاصل شد. محلول نمکی بافری  فسفاتی (PBS) و پروتئیناز K از شرکت Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) به دست آمد. کلیه مواد دیگر جزء رتبه های تحلیلی و دارویی از شرکت SigmaAldrich حاصل شد.
سلول های پایه مزون شیمی انسانی (MSCs )
سلول های پایه مزون شیمی انسانی حاصل آمده از مغز استخوان (MSCS ) از کسر تک هسته ای مغز استخوان حلقی (Cambrex, CA)، بر مبنای اتصال به پلاستیک های کشت بافت جدا شده کندروژنیک و فینوتیپهای آدیوپوژنیک در محیط مصنوعی و همچنین به واسطه قابلیت های آنها جهت افزایش تشکیل استخوان در محیط آزمایشگاهی و همچنین در محیط طبیعی توصیف می شوند. سه سری از آزمایشات مستقل اجرا شدند که هر کدام با نمونه های سه نسخه ای برای هر گروه آزمایشی، نقطه داده و روش تحلیلی مشخص شدند.
سلول های اندوتلیال وریدی نافی انسانی (HUVECs)
رگهای نافی تازه از بخش کودکان تازه متولد شده در دانشگاه کلمبیا پس از کسب مجوز بر مبنای پورتکل IRB (RBAAAC4839) تهیه شدند. جهت ایزوله سازی HUVECs، این رگ با استفاده بافر HEPES جهت حذف خون پسمانده شسته شده و سپس برای مدت ۱۵ دقیقه جهت حذف سلول های اندوتلیال با تریپسین تحت فراوری قرار گرفت. سلول ها از رگ با HEPES شسته شده و در لوله های سانتریفوژ جمع آوری گردیدند. تعلیق در g۳۰۰ برای مدت ۵ دقیقه تحت سانتریفوژ قرار گرفته و مواد شناور حذف گردید.    سلول ها مجددا در EGM تحت فرایند تعلیق مجدد قرار گرفته و در فلاسکهای کشت بافت تحت کشت قرار داده شدند. سلول های غیر چسبنده پس از یک روز شسته شدند. به هنگامی که HUVECs  به صورت همشار رشد یافت، آنها تحت فرایندهای تریپیسین، شمارش و کرایوپیزرو یا نگهداری در دمای کاملا پایین قرار گرفتند.
 
 مطالعات غربالگری رسانه
در این بررسی، HUVECs  در EGM به سمت چهارمین مسیر گسترش داده شد. HUVECs  که در مطالعات غربالگری اولیه استفاده شده بود در رسانه عاری از سرم در ۱۰۶ × ۱ cells/mL به حالت تعلیق در آمده و سپس در ۱۰ ml/mL مرتبط با Vybrant DiI (میله های ملکولی) برای ۳۰ دقیقه در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد آنکوبه گردید. سلولها برای زدودن رنگ اضافه به مدت سه بار قبل از ترکیب با hMSCs  شسته شدند، که این ترکیب به نسبت ۱:۱ انجام گردیده و در هیدروژل فیبرین در حفره های یک پلیت یا ظرف ۹۶ حفره ای آزمایشگاهی کپسوله گردیده و برای ۶ هفته در محیط آزمایشگاهی کشت شد. یک نسبت ۱:۱ در مطالعات پیلوت (که البته داده ها نشان داده نشده اند) انتخاب گردیده و فراهم آورنده شبکه های قدرتمند و ثابت وریدی بوده اند در حالیکه قابلیت تشکیل استخوان نیز وجود داشته است. هیدروژلها نیز به پنج گروه بر حسب رسانه های رشد مختلف تقسیم شدند. این موارد شامل رسانه استخوان ساز (OM) شامل DMEM دارای گلوکز اندک، ۱۰% FBS، ۱% Pen–Strep همراه با فاکتورهای استخوان ساز:    ۱۰۰ nM دگزامتازون، ۱۰ mM سدیم- b– گلیسروفسفات و ۵۰ mg/mL اسکوربیک اسید-۲- فسفات می باشد. دیگر گروه ها فراهم آورنده EGM یا یک کاکتیل OM و EGM در یک نسبت ۱:۱ می باشند. دامنه موقتی به وسیله فراهم آوردن سلول های EGM تنها برای دو هفته در پی کاکتیل برای دو هفته متعاقب یا رسانای کاکتیل با حالت مکمله با ۱۰ ng/ml BMP-2 مورد بررسی قرار گرفتند. رشد ساختارهای وریدی نیز با استفاده از یک میکروسکوپ هم کانونی  Zeiss۵۱۰ و با بهره گیری از یک تصویر با ضخامت ۲۰۰ میکرومتر با فضای ۱۰ میکرومتر بین اسلاید ها تصویر برداری گردید.
 
چارچوب های استخوانی سلول زدایی شده
پلاک های استخوانی (با قطر ۴ میلیمتر ضرب در بلندی ۲ میلیمتر) همانند مطالعه قبلی ما فراهم شد. به طور اختصار، استخوان میله مانند در ناحیه سابکندورال  مربوط به اتصالات کارپومتاکارپال گوساله ۲  هفته ای الی ۴ ماهه، قرار گرفته و سپس با جریان سرعت بالای آب شسته شده تا آنکه مغز استخوان از منافذ آن شسته گردد و پس از آن به صورت ترتیبی در PBS، بافر هیپوتنیک، مواد شوینده و محلول آنزیمی جهت حذف مواد سلولی باقیمانده شسته شد. در انتهای این فرایند، پلاکهای سلول زدایی شده استخوانی به صورت مکرر در PBS شسته شدند و سپس با فرز نمودن خشک گردیده و به بخش های چارچوب مانند برای کشت سلولی بریده شدند. وزن خشک و طول دقیق هر پلاک اندازه گیری شد و جهت محاسبه دانسیته و میزان تخلخل این چارچوب محاسبه گردید. چارچوب ها در ابتدا در اتانول ۷۰ درصد برای یک روز استریل شده و در رسانه کشت یا در ظرف کشت در خلال یک شب قبل از پرورش سلولی آنکوبه گردیدند.
آنکوبه سازی سلولی و پرورش آن
جهت تهییج تشکیل استخوان، تعلیق۲۰ ml مرتبط با MSCs  در یک چگالی ۱۰۶ × ۱۰ cells/mL به چارچوب های بلات – خشک پرورش یافته و به پنج گروه تقسیم شدند و در خلال شب آنکوبه گردیده تا آنکه اتصال سلولی همان گونه که در شکل ۱ نشان داده شده است محقق شود. در روز اول، محلول های فیبروفیبرینوژن (۵ mg/mL) و ترومبین (۱۰ Units/mL) مهیا گردیدند. در گروه های ۱ الی ۴، HUVECs  و MSCs  که می بایست شبکه وریدی ثابت را تشکیل دهند، در فیبرین به نسبت ۲:۱ و چگالی ۱۰۶ × ۳۰ cells/mL کپسوله شدند. ترموبین جهت پیوند متقاطع ژل اضافه گردید تا آنکه غلظت نهایی فیبرین به میزان ۴ mg/mL حاصل شود. قبل از این پیوند متقاطع، ۲۰ ml از سوسپانسیون سلول/ ژل در چارچوب های بلات- خشک به وسیله پیپت ؟/ اندازه گیری شده تا آنکه قابلیت کشت یکنواخت سلولی در چارچوب ها فراهم گردد. قبل از آنکه ژل ها به صورت کامل دارای پیوند عرضی گردند، آنها تحت یک واکیوم سبک تحت خلأ قرار گرفتند به گونه ای که ژل فیبرین جداره های این چارچوب ها را تحت پوشش قرار داد، اما فضاهای منفذ را پر ننمود. در گروه ۵، مرحله مشابهی بر روی چارچوب های کشت MSC پس از چهار هفته کشت استخوانی اعمال گردید.
کشت در محیط آزمایشگاهی
پنج گروه آزمایشی جهت بررسی ساختارهای استخوانی عروقی شده شامل سه گروه اصلی و دو گروه شاهد آماده شدند (شکل ۱). گروه ۱ (جهت کنترل شرایط پیدایش استخوان) از رسانه استخوان ساز ((OM) در خلال کشت استفاده نمود که حاول گلوکز پایین (OM، ۱% FBS، ۱% Pen–Strep تکمیل شده به وسیله فاکتورهای استخوان ساز: ۱۰۰ nM دگزامتازون، ۱۰ mM سدیم- b– گلیسروفسفات، و ۵۰ mg/mL اسکوربیک اسید-۲ – فسفات، تکمیل شده با BMP-2 (در ۱۰ ng/mL) برای مدت ۶ هفته استفاده شدند. گروه ۲ (جهت کنترل شرایط عروقی ژنی) از رسانه رشد اندوتلیال در طی این کشت استفاده نمود.       گروه ۳ نیز از EGM برای ۲ هفته استفاده نموده و سپس یک رسانه کوکتل متشکل از EGM و OM با نسبت ۱:۱ (EGM|cocktail) برای چهار هفته مورد استفاده قرار گرفت. گروه ۴ دقیقا همانند گروه ۳ طراحی شده بودند به استثنای آنکه MSCS  شامل – استخوان نیز در فضاهای منفذ چارچوب به مدت زمانی ۲ هفته اضافه شده بود (EGM|cocktail+MSC). در گروه ۵، MSCs  تنها در داخل داربست ها کشت شده و نهایتا در رسانه استخوان ساز برای ۴ هفته مورد کشت قرار گرفت که در آن نقطه HUVECs  و MSCS  در فیبرین به این مجموعه اضافه شده و در رسانه کوکتل برای ۲ هفته اضافه کشت گردیدند (OM|cocktail).
کشت در محیط طبیعی
پس از ۶ هفته کشت در محیط مصنوعی، کلیه عناصر این گروه ها برای مدت ۲ هفته در زیر پوست موش در محیط طبیعی مورد ارزیابی قرار گرفتند. موش NOD SCID                                    (NOD.CB17-Prkdcscid/NCrHsd, Harlan) به وسیله تزریق کتامین (۱۰۰-۸۰ mg/kg) و زیالازینگ (۱۰-۵ mg/kg) بیهوش شد. این بیهوشی با استفاده از بوپرنورفین (۱/۰-۰۵/۰ mg/kg) حاصل آمد. اجزای مربوطه در بخش های مجزای بخش پشتی زیر پوستی موش کشت شد (هر بخش در یک پاکت، دو پاکت برای هر حیوان) که بر مبنای رویه پذیرفته شده کمیته بین المللی مراقبت و استفاده از حیوانات دانشگاه کالیفرنیا (IACUC) انجام گرفت. موارد ایمپلنت شده پس از ۲ هفته برای آنالیز پیوند ورید خونی و رشد استخوان از بدن موش ها خارج شد.
سنجش DNA
بخش های مختلف این ساختار در PBS شسته شده و سپس به دو نیم تقسیم گردیده و در داخل لوله های میکوسانتیفوژ قرار گرفته و در طول شب در دمای ۵۶ درجه سانتیگراد در بافر هضم ۱/۰ mg/mL  (۱۰ mM Tris، ۱ mM EDTA و-۱۰۰  Triton X ۱%) حاوی پروتوئیناز K آنکوبه گردید. بخش های شناور جمع آوری شده و به میزان ده برابر رقیق گردیده تا آنکه یک محدوده خطی برآورد پیکوگرین حاصل شود. یک منحنی استاندارد از محلول باکتریوفاز DNA l از میله های مولکولی به دست آمد. رنگ پیکوگرین (میله های مولکولی OR) در ظروف ۹۶ حفره ای نمونه ها اضافه گردید (رنگ ۱۰۰mL ) و به وسیله سیستم فلوروسنت ؟؟ (با درجه برانگیختگی ۴۸۵nm ، انتشار ۵۲۸ nm) خوانده شد.
 
بررسی حالت زنده- مرده
بخش های مختلف به دو قسمت تقسیم شده و در PBS شسته گردیده و در کلسین AM آنکوبه شد (که معرف سلول های زنده می باشد) و این عمل برای اتیدیوم هومودیامر- ۱ ( که معرف سلول های مرده است) نیز بر حسب پروتکل شرکت سازنده انجام گردید (LIVE/DEAD (R) Viability/Cytotoxicity Kit، Molecular Probes) و نهایتا با استفاده از یک میکروسکوپ هم کانون تصویر برداری شد. اسلایدهای نوری از ۱۰۰ در فواصل ۱۰ میکرون تا عمق ۱۶۰ میکرومتر حاصل گردیده و به عنوان یک نمای عمودی ارائه شد.
ایمونوهیستوشیمی
اجزای مختلف پس از شسته شدن در PBS و تثبیت شدگی در ۱۰ درصد فرمالین برای مدت دو روز با محلول امیونوکال کلسیم زدایی شده و اتانول رتبه بندی شده آب زدایی گردیدند و سپس در پارافین به میزان ۵ میکرون قرار گرفته و بر روی اسلایدهای شیشه ای نصب شدند. این بخش ها سپس با استفاده از سیتریسولو پارافین زدایی گردیده و با استفاده از مواد شوینده اتانول مجددا آبدهی گردیده و با سرم معمولی بلوکه شده و با بهره گیری از پاتتن های اولیه و پس از آن پاتتن ثانویه لکله گیری شده و با سیستم بیوتین / آویدین رشد داده شدند. ایمونوهیستوشیمی برای کلاژن انسانی (Abcam ab6308) سیلوپروتئین دو استخوانی (BSP) (Chemicon AB1854CD31 (۰۴-۱۰۷۴ Millipore) و عامل ونویبراند (vWF) (Sigma-Aldrich F3520) اعمال گردید. رویه ضد لک زدگی نیز با کاربرد هماتوزیلن استعمال شد. سرم، پاتتن ثانویه و واکنشگرهای مربوطه از لابراتورهای ویکتور تهیه شد و شامل کیت ABC (universal) (PK6200) و کیت زیر لایه DAB/Ni (SK-4100) می باشد. کنترل های منفی از طریق حذف پاتتن های اولیه در مرحله آنکوبه سازی اعمل گردید.
 
 رادیولوژی ریزکامپیوتری (mCT)
mCT بر روی کلیه ۵ گروه مشخص شده پس از ۶ هفته کشت در محیط آزمایشگاهی اعمال گردید. به عنوان یک شاهد، داربست های کشت نشده در OM باقی ماند که در خلال دوره کشت همچنان ثابت مانده و در این زمان مورد تحلیل قرار گرفت. اصلاح پروتکل توسعه یافته قبلی نیز مورد استفاده قرار گرفت.    نمونه ها در امتداد مسیر محوری هم طراز شده و در یک لوله سانتریفوژ ۲ mL که در داخل نگهدارنده نمونه سیستم vivaCT 40 قفل شده بود به صورت تراز در آمدند (SCANCO Medical AG، Basserdorf، Switzerland). طول ۲ میلیمتری داربست به اندازه وکسل ایزوتروپیک ۲۱ میکرون اسکن شد. حجم کلی استخوان (BV) مسئول مجموع ماتریس استخوانی در این داربست بوده و استخوان مینرالیزه جدید از کاربرد تکنیک آستانه سازی عمومی حاصل آمد به گونه ای که بافت مینرالیزه شده تشخیص داده شد. کسر حجمی استخوان (BV/TV) به عنوان نسبت BV و حجم کلی (TV) نمونه مشخص گردید. رزولوشن فضایی این مدل وکسل کامل برای ارزیابی ریزساختار نمونه ها به میزان کفایت تشخیص داده شد.
 
ارزیابی پیوند محیط طبیعی و تشکیل استخوان جدید
پس از ۲ هفته ایمپلنت زیرپوستی در موش NOD SCID نمونه ها جمع آوری گردیده و در PBS شسته شده و تصاویر میکروسکوپی با استفاده استریومیکروسکوپ یا میکروسکوپ سه بعدی مورد پردازش قرار گرفتند. نمونه ها نصف شده و برای بافت شناسی نرم و سخت بافت ها به کار گرفته شدند. پیوند محیط آزمایشگاهی قابلیت رشد شبکه های مویرگی با سیستم عروقی میزبان را داشته که این مورد با استفاده از ایمیونوکلازیسیون CD31 انسانی (Millipore 04-1074) که در بالا تشریح شد مورد ارزیابی قرار گرفت. کانتراستینیگ با هماتوزیلین جهت تشخیص سلولهای قرمز خونی موش در داخل لومن مویرگی انسانی اعمال گردید. تشکیل استخوان جدید بر روی بخش هایی که هنوز کلسیم زدایی نشده اند بر مبنای روش بافت شناسی سخت اعمال گردید: بخش ها در فرمالین ۱۰ درصد برای یک روز تثبیت شده و با شستشوهای ترتیبی در ۷۰ درصد اتانول (۲ روز)، ۱۰۰ درصد اتانول (۲ روز با تغییرات محلولی دو بار در روز) و تالوئین (۲ روز با تغییر محلول یک بار در روز) تحت فرایند آب زدایی قرار گرفتند. این اجزا سپس در متیل متاکریلیت فعال (MMA) با توجه به تغییرات روزمره محلول MMA برای چهار روز در دمای ۴ درجه سانتی گراد شسته شده و سپس در دمای ۳۲ درجه سانتی گراد قرار گرفته تا آنکه MMA به عمل آید. بخش های محاط شده – پلاستیکی نیز به ۸ میکرون بر روی یک دستگاه ریزبر یا میکروتوم بافت سخت Leica تقسیم شدند. فرایند رنگ پذیری برای تشکیل استخوان جدید با استفاده از رنگ سه تایی Goldner’s Masson انجام پذیرفت.
اطلاعات آماری
آنالیز آماری با استفاده از نرم افزار GraphPad انجام شد. یک آنالیز یک تحلیل واریانس یک طرفه (ANOVA) با استفاده از آزمون مقایسه ای چند گانه توکی انجام پذیرفت تا آنکه تفاوت معنی دار آماری در بین گروه ها مشخص شود. P < 0.05 به صورت معنی دار آماری مشخص گردید. داده ها به عنوان میانگین SD± مشخص شدند.
 
 نتایج
تشکیل شبکه های عروقی در هیدروژل های فیبرین
ما تایید نمودیم که شبکه های مویرگی تشکیل شده از HUVECs  تنها در حضور MSCs  و در شرایط آزمایشگاهی دارای ثبات می باشند (شکل S1). شبکه های قدرتمند به وسیله میکروسکوپ هم کانون در خلال ۲ هفته کشت در رسانه رشد اندوتلیال مشاهده شد (شکل S2– گروه EGM) و به صورت ثابت در خلال ۶ هفته کشت باقی ماند. به هنگامی که OM به عنوان دوره شروع کشت به کار گرفته شد (شکل S2– گروه OM)، سلولها قابلیت تشکیل شبکه ها را نداشتند. در مقابل، میزان قابل توجهی از پسماندها از HUVECs  به وسیله میکروسکوپ هم کانون مشاهده شد (و به عنوان یک پارامتر ساختگی برای ارزیابی زیست پذیری HUVEC به کار گرفته شد) سلولهای داخل رسانه کوکتل (نسبت ۱:۱ EGM+OM) تشکیل دهنده شبکه های عروقی می باشند، که شواهد آن از طریق تصاویر هم کانون قبل از رنگ نمودن HUVECs مشخص  شده است. با این حال مقدار بالای پسماندهای سلولی مشاهده شدند (شکل S2– گروه کوکتل).
تشکیل شبکه های استخوانی و مویرگی در داربست های کشت شده در محیط آزمایشگاهی
بر مبنای مطالعات غربالگری اجرا شده بر روی ژل فیبرین، ما کلیه رساناهای استخوان ساز را با BMP-2 تقویت نمودیم که علت آن حفظ زیست پذیری جمعیت اندوتلیال بوده است. HUVEC و hMSCs  به صورت یکنواخت در داربست استخوانی سلول زدایی شده کشت گردیده و به صورت شایع بر روی سطوح جداره مشخص شد (شکل S3). میزان DNA این اجزا مشخص کننده آن می باشند که تکثیر سلول ارتقاء یافته به میزان قابل توجهی بیشتر از OM می باشد ((p < 0.05) EGM). این مورد به طور آشکار یک واکنش سلولی مشخص برای عوامل رسانه OM می باشد چرا که EGM|cocktail نیز همچنین دارای سلول های بیشترین در مقایسه با EGM به تنهایی است. بدون تعجب، گروه ۴ (EGM|cocktail+MSC) و گروه ۵ ۰ OM|cocktail) دارای بیشترین سلولها بوده اند (شکل ۲)، که معرف اضافه شدن سلولهای بیشتری بدین ساختارها می باشد. میکروسکوپ هم کانون قابلیت نمایش زیست پذیری سلولی در کلیه   گروه ها را دارا می باشد (سنجش مرده/ زنده) و شبکه های مویرگی قدرتمند در گروه ۳ و ۴ (سنجش …) (شکل ۲).
 
خواص شبکه های مویرگی در محیط طبیعی
تصاویر میکروسکوپی گرفته شده با استفاده از میکروسکوپ سه بعدی معرف رشد رگهای خونی به صورت قابل توجه در هر یک از بخش ها می باشد (شکل ۵). در برخی از گروه ها، تزریق خون از طریق ساختارهای شبکه ریز عروقی نیز مشاهده شد. تنها مویرگهای اندکی در گروه OM مشاهده شدند، در مقایسه با دانسیته بالاتر عروقی در گروه EGM. گروه های ۳ و ۴ واسکیوژنز قبل از تمایز استخوانی القای گردیده که معرف رشد شبکه های قدرتمند مویرگی می باشند. کلسیم زدایی ساختارها نیز به صورت مشخص نمودن رنگ با CD31 انسانی جهت تصدیق حضور شبکه های عروقی قبل از کشت و عملکرد در محیط طبیعی مشخص گردید. ساختارهای دارای رنگ مثبت با سلولهای داخلی در کلیه گروه ها مشخص شدند که واسکیوژنز یا پیدایش عروقی نیز قبل از پیدایش استخوانی القای شد (گروه ۳ و ۴) که خود معرف آن است که سیستم عروقی تزریقی منشاء انسانی دارد (شکل ۵ و شکل S4) با وجود سلولهای دارای رنگ به صورت مثبت در گروه OM|cocktail، این رگها از رشد خوبی برخوردار نبوده و هیچ گونه شواهدی از تزریق مشخص نشد. پیوندهای کلسیم زدایی نشده که از مطالعات آزمایشگاهی حاصل شدند با استفاده از سیستم Non-decalcified رنگ آمیزی گردیده تا آنکه بخش های استخوانی مشخص شوند که بر مبنای آن میزان بیشتری از این موارد در گروه های OM و EGM|cocktail+MSC مشخص گردید. به طور آشکار، کمترین میزان تشکیل استخوان در گروه EGM مشخص شد.

 

مدل پیشنهادی رشد استخوان عروقی شده در محیط آزمایشگاهی
در مطالعات اولیه هیدروژل، ما دریافتیم که با فراهم آوردن رسانه استخوان ساز به صورت هم کشت با HUVEs و hMSCs  رویه تقریبی یا زیان آور برای تشکیل سیستم عروقی تشدید خواهد شد. در نتیجه، مطالعات بعدی سعی در توسعه رویه رشد سیستم عروقی قدرتمند از طریق کاربرد EGM برای دو هفته نمودند. مطالعات اولیه نشان داد که ساختارهای موئینه ای مانند یا مویرگی مانند به وسیله HUVECs  در ظرف چند روز شکل یافته و تنها در صورت حضور hMSCs  حالت با ثبات یافته اند. این موضوع مشخص کننده آن است که hMSCs  ممکن است نقش یک یاخته کوچک جنینی شکل را در این سیستم به عهده داشته باشد (شکل ۶). یک دیدگاه شایع در این مبحث آن است که فرایند مهاجرت سلولی پریوسکلار و به کار گیری مجدد آن از طریق سیگنالینگ PDGFR میسر می باشد. اضافه نمودن ترتیبی فاکتورهای استخوان ساز به EGM و تظاهر بالقوه BMP به وسیله EC’s سبب تسهیل تشکیل استخوان … (به صورت مجدد) از طریق hMSCs  نامتمایز در خلال چندین هفته می شود. تشکیل استخوان به هنگامی که MSCs  القای شده استخوانی به داربست های استخوانی در زمان مشابه با مکمل های استخوان ساز اضافه می شوند حالت تقویت شده ای را خواهد یافت. به علاوه، مطالعات متعددی نشان داده اند که BMP قابلیت  شبیه سازی تظاهر VEGF در استئوبلاست ها و VEGF به صورت هم طراز با BMP-2 mRNA  و تظاهر پروتئین در سلولهای اندوتلیال میکرو عروقی را خواهد داشت.

 

مباحث
هدف اصلی این مطالعه بررسی این فرضیه است که کاربرد ترتیبی فاکتورهای رشد، در ابتدا قابلیت القای تشکیل سیستم عروقی ثبات را داشته و سپس قابلیت مشخص نمودن تمایزات اولیه استخوان سازی را نیز خواهد داشت، که خود فراهم آورنده یک روش القای بیولوژیکی در محیط آزمایشگاهی در خصوص     عروقی سازی استخوان می باشد. تا اینجا، ما به صورت سیستماتیک شرایط کشتی را مورد بررسی قرار دادیم که سبب مشخص سازی ساختارهای عروقی اصلی و توانمند سازی استخوان سازی با استفاده از همکشتهای HUVEC-MSC در تعامل با مهندسی بافت توسعه یافته قبلی و روش های بیوواکنشی یا  زیست واکنش پذیر می باشد. ما پیشنهاد می نماییم که سیستم استفاده شده در این بررسی می بایست از یک روش متناسب مهندسی بافت در مبحث استخوان عروقی سازی شده برای مطالعات مکانیکی و تعاملات سلول به سلولی بین سلولهای اندوتلیال و پروجنیستورهای استخوان ساز برخوردار باشد. در حقیقت، مطالعه اخیر نشان دهنده آن است که سلولهای اندوتلیال عروقی ممکن است یک قابلیت ذاتی در زمینه انتقال یا عبور به پروجنیستورهای مزون شیمی را داشته باشد و بنابراین احتمالات قابل توجهی را برای نقش سلولهای اندوتلیال در این  مدل پیش روی ما فراهم می سازد.

 

در مطالعات آتی، این موضوع نیز مرتبط خواهد بود تا نسبت به مشخص نمودن آنکه آیا HUVECs و MSCs به طور مساوی در این گروه شبیه سازی شده اند اقدام شود و همچنین قابلیت کشف نقش تکثیر سلولی در رشد بافت نیز محرز گردد. به علاوه، علیرغم نتایج نوید دهنده، مطالعه ما این موضوع را مشخص می سازد که کوکتل های جایگزین (نظیر EGM|OM یا فاکتور رشد عروقی فزاینده با تمرکز در گروه OM|cocktail) را می توان به صورت هم نیروزایی جهت ارتقای مینرالیزه شدگی با تشکیل شبکه عروقی مورد ارزیابی قرار داد. همچنین، مطالعات بعدی نیز می بایست جهت بهینه سازی مراحل زمانی کشت انجام پذیرند، چرا که دوره دو هفتگی القای عروقی بر مبنای ساختارهای شبکه قدرتمند مشاهده شده برای مطالعات ژن فیبرین انتخاب شده بود.

 

لطفا به جای کپی مقالات با خرید آنها به قیمتی بسیار متناسب مشخص شده ما را در ارانه هر چه بیشتر مقالات و مضامین ترجمه شده علمی و بهبود محتویات سایت ایران ترجمه یاری دهید.
تماس با ما

اکنون آفلاین هستیم، اما امکان ارسال ایمیل وجود دارد.

به سیستم پشتیبانی سایت ایران ترجمه خوش آمدید.