محدودیت های آزمایشی جهت کاربرد سلول های دارای قابلیت برنامه ریزی مجدد برای متمایزسازی سلول های خون ساز

محدودیت های آزمایشی جهت کاربرد سلول های دارای قابلیت برنامه ریزی مجدد برای متمایزسازی سلول های خون ساز – ایران ترجمه – Irantarjomeh

مقالات ترجمه شده آماده گروه پزشکی

مقالات ترجمه شده آماده کل گروه های دانشگاهی

مقالات رایگان

محدودیت های آزمایشی جهت کاربرد سلول های دارای قابلیت برنامه ریزی مجدد برای متمایزسازی سلول های خون ساز

ژورنال بیوپزشکی و بیو فناوری

گروه ارشد تحقیقاتی لنفوسیت، انستیتو مکس پلنک آلودگی بیولوژی، برلین، آلمان

2011

 چکیده

در این مقاله ما نسبت به بررسی تجارب محیط آزمایشگاهی در خصوص برنامه ریزی مجدد سلول های سوماتیک، جهت ایجاد سلول های بنیادی چند توانی (iPSC) و توسعه متعاقب آزمایشگاهی سلول های خون ساز از iPSC و تشکیل سلول های بنیادی جنینی (ESC) اقدام می نماییم. در عین آن که، به صورت عملی، برنامه ریزی مجدد و تمایز متعاقب آزمایشگاهی از قابلیت ایجاد سلول خون ساز از هر گونه سلول های سوماتیک برخوردار می باشد، این موضوع آشکار است که قبل از کاربرد این مولفه برای سلول های انسانی و استفاده در محیط بالینی کشت سلول بنیادی خون ساز (HSC) لازم است بسیاری از مراحل این فرایند را به طور قابل توجهی ارتقا داد.

1. مقدمه

تولید آزمایشگاهی سلول های بنیادی خون ساز (HSC) و سلول های خون ساز بالغ از سلول های بنیادی جنینی (ESC) به عنوان یک مولفه قابل توجه در خصوص فراهم آوردن یک منبع جایگزین سلولی مد نظر می باشد که قابلیت جایگزینی کل سلول های مغز استخوان یا کسرهای غنی شده – HSC آنها را خواهد داشت. چنین موردی مخصوصاً در ارتباط با سلول های انسانی تحت محیط بالینی برای پیوند HSC ضروری می باشد. بعلاوه، مطالعه سلول های خون ساز تحت شرایط آزمایشگاهی آن قدر پیشرفت نموده است که دیگر نیازی به سلول های دهنده وجود ندارد، مخصوصاً در این زمینه می توان به بررسی ناهنجاری های سلول های خون ساز در انسان اشاره داشت. خطوط ESC را می توان به صورت طویل المدت مورد کشت قرار داد و در تضاد با HSC می توان نسبت به باز ترکیب همسان DNA نیز اقدام نمود که خود بعنوان یک ویژگی الحاقی ژن های اصلاح شده برونزاد در مناطق مناسب ژنوم به شمار می آید. بنابراین، HSC حاصل آمده – ESC، با قابلیت جایگزینی ژنتیکی می تواند سبب ترمیم مناسب ژنتیکی سلول های ناقص سیستم خون ساز، شامل سلول های اصلی و سلول های سیستم ایمنی انطباقی، شود. با این وجود، در خصوص پیوند سلول های انسانی مولفه هایی نظیر بافت سازگاری سلول های انسانی بین HSC حاصل آمده از – ESC و میزبان را می توان به عنوان دلیل رد یا پس زدن پیوند تلقی نمود.  

از آن جایی که هم اکنون قابلیت ایجاد سلول های بنیادی پر توان القا شده همانند – ESC (iPSC) از سلول های جانبی متمایز شده وجود دارد [1،2] HSC همراه با سلول های خون ساز بالغ را می توان متعاقباً از این سلول های تمایز یافته بیماران از طریق iPSC تولید نمود. سلول های سوماتیک که به صورت بالغ، یا سلول های کاملاً متمایز و یا محدود از نقطه نظر قابلیت خود می باشند، از نظر توسعه به یک مجموعه محدودی از انواع سلول ها، را می توان به عنوان سلول های پر توان به کار گرفت به گونه ای که آن ها قابلیت ظرفیت تفاضلی بالاتری را داشته باشند. این فرایند تحت عنوان برنامه ریزی مجدد خوانده می شود. البته تاکنون این موضوع آشکار نشده است که آیا فرایند برنامه ریزی مجدد غالباً مساوی با انجام فرایند تمایز است یا خیر. گسترده ترین روش به کار گرفته شده جهت القای iPSC از سلول های سوماتیک از بیان بیرونی عامل های پیوند Oct-4، Sox-2 و Klf-4 با و یا بدون c-myc استفاده می نماید [1،3 – 8]. با این وجود، با توجه به کاربردهای محدود بالینی حاصل آمده از بیماران، یعنی تبدیل مستقیم iPSC، شامل تفاوت های اپیژنیک بالقوه بین iPSC و ESC [9-18]، و اصلاح های محتمل ژنوم به وسیله الحاق و بیان پیوسته فاکتورهای نسخه برداری می توانند به طور موثری بر روی ظرفیت های برنامه ریزی مجدد iPSC به منظور تفکیک مناسب تاثیر گذار باشند. در این مورد تحت بررسی، ما برخی از محدودیت های توسعه آن ها در HSC و همچنین لیگاندهای سلول خون ساز متمایز شده را مورد بررسی قرار می دهیم.

چندین مطالعه اقدام به ارائه ویژگی های iPSC از تعداد متنوعی از سلول های تمایز یافته نموده تا از این طریق قابلیت یافتن کارآمدترین روش را بوجود آید. به طور کلی، تلاش هایی جهت بهینه سازی هر دوی عامل های درونی و برونی – سلولی جهت حاصل آوردن رشد بهینه، تداوم زیست و تمایز ضروری، در ابتدا برای فاز ترانسفکشن و متعاقباً برای تبدیل از سلول های تمایز یافته به iPSC انجام شده است [1،3-8]. مطالعات بسیاری نیز نشان دهنده ویژگی های اشتراکی iPSC مرتبط با ESC می باشند، بدان معنا که آن ها قابلیت ایجاد کلیه انواع سلول های مناسب بدن مد نظر است که از طریق پیشرفت و شکل گیری حیوانات کایمریک و همچنین شکل گیری تومور متشکله از انساج جنینی حاصل شده است [1]. با این وجود، این تحلیل های کیفی قابلیت فراهم آوردن اطلاعات در خصوص کارایی کمی ویژگی های توسعه در این زمینه را نداشته اند. بنابراین، جهت بررسی این موضوع که آیا iPSC قابلیت جایگزینی ESC را خواهد داشت یا خیر و به منظور مطالعه پیشرفت و کاربردهای بالینی، لازم است تا کارآمدی ها و مولفه های مرتبط در این زمینه ارائه و مورد بحث قرار گیرند.

در این جا، ما تجربه خود با توجه به آزمایش انجام شده بر روی فیبرو بلاست های جنینی موش با قابلیت تبدیل Oct-4/Sox- 2/Klf-4-transduced (MEF)، پروتئین های خون ساز حاصل آمده از مغز استخوان موش (MBM) و preB-لیمفوسیت های حاصل آمده از کبد جنینی موش تحت بررسی محیط آزمایشگاهی و با کاربرد iPSC را ارائه می نمائیم که نشان دهنده سطوح مختلف بیان پیوسته فاکتورهای پیوند در iPSC و سلول های خون ساز متمایز در این زمینه می باشد. این سطوح بیان تراژنی مرتبط با پر توانی iPSC در خصوص تمایز متعاقب آزمایشگاهی سلول های خون ساز قابل توجه است.

پیشرفت سلول های خون ساز از ESC و iPSC به عنوان یکی از بهترین برنامه های تمایزی مورد مطالعه می باشد. سیستم های پرورشی که در این زمینه ارائه شده اند قابلیت ایجاد تمایز سویه های خون ساز تحت محیط آزمایشگاهی از ESC و iPSC را می دهند [19-27]، که بر این مبنا ما سعی در بهینه سازی آن برای سلول های مغز استخوان، همراه با سلول های T، NK و B نموده ایم [28]. با این وجود، توسعه کارآمد و حفظ ویژگی های بازسازی محیط آزمایشگاهی HSC از ESC و همچنین iPSC همچنان به عنوان یک مولفه چالش برانگیز به شمار می آید. برای راهکارهای بالینی ایجاد HSC با قابلیت پیوند، در ابتدا، بهترین نوع سلولی متمایز برای تبدیل به iPSC با بهترین عامل های درونی و برونی سلولی مشخص گردیده اند. بنابراین، روش های ارتقا یافته ای را می بایست جهت تولید و تثبیت ویژگی های پرتوانی، یعنی مولفه های بالقوه بازسازی طویل المدت HSC قابل پیوند، در نظر گرفت.

2. سلول های سوماتیک با قابلیت برنامه ریزی مجدد به عنوان منابع جدید تولید سلول های خون ساز

2-1. مرحله 1 : از سلول های تمایز یافته به iPSC

سلول های سوماتیک در ابتدا به وسیله فرایند انتقال هسته سلول سوماتیک تحت فرایند برنامه ریزی مجدد قرار می گیرند [29-31]. متعاقباً، عامل های نسخه برداری مرتبط با – دودمان در داخل یک حوضچه متشکل از 24 عامل مرتبط چند توانی مشخص می گردند که دارای پتانسیل برنامه ریزی مجدد سلول های بالغ به سلول های چند توان در پی انجام فرایند انتقال یا ترارسانی رتروویروسی می باشند [1]. بنابراین، ترارسانی یا انتقال فیبروبلست های موش در Oct-4، Sox-2، Klf-4 و c-myc-generated ایجادی iPSC به وسیله انتخاب برای فعال سازی Fbxo15 که بیان کننده مارکرهای چند توانی می باشند حاصل آمده و در نهایت قابلیت تراتوم ها با استفاده از فرایند تزریق زیر پوستی در تعامل با بافت های مختلف در پی تزریق بلاستوسیت حاصل می شود [1]. فاکتور نسخه برداری بر مبنای برنامه ریزی مجدد نیز بهینه سازی شده است، به گونه ای که c-myc حذف شده و سلول ها با توجه به فعال سازی مجدد Nanog و Oct-4 انتخاب گردیده و همچنین این فرایند از طریق کنترل مورفولوژی شبه – ESC دنبال می شود [4،6، 8،32]. حقایق، فرضیه ها و مسایل حل نشده برنامه ریزی مجدد سلولی [33] و همچنین حفظ و نگهداری و تغییر حافظه اپی ژنیک در iPSC [34] اخیراً به طور گسترده ای مورد بحث قرار گرفته است. این مورد که به وسیله Hanna و همکاران [33] خلاصه شده است، مشخص کننده بیان های ژن و ویژگی های بیولوژیکی iPSC می باشد که ممکن است تحت تاثیر سوابق ژنتیکی (سویه های مختلف موش، دهنده سالم در برابر iPSC حاصل آمده از بیماران) تشکیل ناکامل یا ناهمگن iPSC، عامل های اضافه یا جایگزین در ارتباط با برنامه ریزی و ویژگی بیان – ترانس ژن iPSC می باشد.

در این آزمایشات، ما از روش ترارسانی رتروویرال با سه بردار استفاده نمودیم که به صورت پیوسته قابلیت بیان Sox-2، Oct-4 و Klf-4 به ترتیب را داشته و در آن ژن های عامل نسخه برداری قابل حذف شدن نمی باشند، به طور مثال، از طریق حذف مورد اصلاح شده – cre/lox. ما اقدام به ایجاد خطوط iPSC از MEFs و MBM نمودیم. کلیه خطوط iPSC ما بیان کننده نشانگرها و ویژگی های – ESC می باشند و تشکیل دهنده تومور تحت شرایط آزمایشگاهی هستند [28].

بیان ترانس ژن پیوسته در خطوط iPSC ما در سطوح مختلف، حتی در امتداد مولفه های متمایز سازی با سلول های خون ساز تحت شرایط آزمایشگاهی به نظر محتمل می باشند. به هنگامی که چنین موردی اندازه گیری شد، یک تفاوت قابل توجه پدیدار می گردد. کلیه خطوط MEF-iPSC نشان دهنده الگوهای بیان سه فاکتور نسخه برداری تراژنی می باشند که به سختی فراتر از ژن های اندو ژنی متناظر هستند، در حالی که کلیه خطوط MBM-iPSC نشان دهنده بیان نسبتاً بالاتر Oct-4، Klf-4 و Sox-2 می باشند. این مورد به نظر می رسد که یک بیان آستانه بالاتر مرتبط با این سه فاکتور جهت برنامه ریزی مجدد MBM-iPSC در مقایسه با MEF-iPSC مورد نیاز است.

2ـ2. مرحله 2 : از ESC و iPSC به HSCs و سلول های سویه خون ساز بالغ

برای تمایز ESC به سمت چندین نوع از سلول های خونساز بالغ دو پروتکل ارائه شده است ـ تشکیل مجموعه های جنینی (EB) که در رسانای تعلیقی شکل یافته و کشت ESC با سلول های استرومایی. در پروتکل اول، ESC قابلیت رشد در حالت تعلیق در غیاب سلول های تغذیه کننده و LIF را داشته و به صورت همزمان می تواند تمایز مشخص را ایجاد نموده و قابلیت تشکیل بافت های جنینی شبیه ساز دانه های کروی که تحت عنوان مجموعه های جنینی خوانده می شود خواهند داشت [35 ـ 38]. سلول ها در داخل EB در حال توسعه قابلیت تمایز سلول های بالغ را خواهند داشت که شامل سلول های سویه خونساز نیز می باشند [39، 40]. سلول های والدین یا اجدادی خونساز، که دارای تمایل جهت وجود به عنوان یک مورد سیار را دارند، سلول های واحد بدون انباشتگی، می بایست بر مبنای راهکارهای مجزاسازی و تفکیک از انباشته ها یا توده های EB تفکیک و مجزا شوند.

در پروتکل دوم، فرآیند هم کشت ESC با سلول های استرومایی پیش ـ چربی اجازه ارائه یک فرآیند تفکیکی دو بعدی در سلول های خونساز بدون تشکیل ساختارهای انباشته پیچیده آنها را داده و بنابراین به عنوان یک فرآیند آسانتر و مؤلفه منفک از توسعه سویه های خونساز به شمار می آیند [21، 27]. به علاوه، کاربرد خط سلولی استرومایی دارای نقص ـ M-CSF از تمایز پیش بلوغی سلول های سویه شبه مغز استخوان جلوگیری نموده و اجازه توسعه سلول های T، NK و لنفاوی B را می دهد [21]. در آزمایشات تمایز ما تحت محیط آزمایشگاهی قابلیت مقایسه ESC و iPSC [28] وجود داشته است ـ مورد دومی به وسیله انتقال رترووایرال با Sox-2، Oct-4 و Klf-4 حاصل آمده است ـ ما یک قابلیت کاهش یافته سلول های شبه مزودرمال حاصله از ـ iPSC جهت تمایز به سویه های خونساز تحت محیط آزمایشگاهی را مشاهده نمودیم. در عین حال Oct-4، Sox2 و Klf-4 همچنان دارای سطح بالایی در سلول های تمایز یافته می باشند. فرا بیان Sox-2 به نظر به صورت معکوس در ارتباط با توان خونسازی می باشد (داده ها در جدول 1 خلاصه شده اند).

شکل 1. بررسی مؤلفه های مربوط به درک جاری کارایی جهت القای iPSC از انواع مختلف سلول های سوماتیکی و توسعه متعاقب iPSC به سلول های خونساز. خطوط بریده مشخص کننده تعداد پایینتر سلول های حاصله از نوع سلول قبلی در مقایسه با خطوط پر می باشند.

در نتیجه گیری، آزمایش ما مؤکد آن است که ـ همانند موارد دیگر [41] ـ بیان ژن های انتقالی ویروسی می بایست قبل از اعمال فرآیند متمایزسازی منقطع و جلوگیری شوند. سه عامل نسخه برداری به نظر بر روی جلوگیری از رشد سلول های خونساز به وجوه مختلف تأثیرگذار می باشند. در عین آنکه Oct-4 و Klf-4 به نظر قابلیت تحمل در سطوح بالاتر جهت ایجاد حداقل سویه ها و پیش کرسرهای مرتبط با توسعه یا رشد سلول T، NK، B و سلول مغز استخوان مانند را دارد، سطوح Sox-2 را می بایست به گونه ای برای توسعه سلول های خونساز تعدیل نمود. از این نتایج، به نظر می رسد که فرابیان عامل های نسخه برداری ترانسژنیک سبب بازداشتن رشد Flk-1⁺ مزودرمال به سویه های خونساز CD45⁺ می شود. بیان تشکیل دهنده یا سازنده نیز به وسیله موارد دیگر نشان داده شده است که البته تأثیری بر روی رشد سلول های iPS و تشکیل سلول های سیستم خونساز نداشته است [42، 43]. از نتایج خود انتظار داریم که بیان تراژنی سه عامل نسخه برداری در خطوط iPSC می بایست در حد اندکی قابل قیاس با خطوط MEF-iPSC ما باشد.

در صورتی که سلول های طبیعی موش یا سلول های سماتیک انسانی برای تولید iPSC بکار گرفته شوند، بردارهای ویروسی می بایست قابل حذف باشند [44] آن هم بدون پیامدهای جهش زای آن، یا آنکه می بایست به عنوان پروتئین ها اقدام به ارائه آنها نمود [45] یا به عنوان mRNA اصلاح شده سنتزی [46].

3. ایجاد HSC از ESC و iPSC و نیاز به ارتقاء

حتی در صورتی که راهکارهای مرتبط با تولید iPSC در نهایت در حد کفایت جهت حاصل آوردن سلول ها با قابلیت تمایز یکسان همانند ESC و تولید متعاقب کارآمد با قابلیت پیوند مطلوب گردد، بازسازی HSC حاصل آمده از سلول های ESC و iPSC همچنان به عنوان یک مشکل باقی مانده اند. iPSC را می توان جهت ایجاد سویه های جدید موش بکار گرفت که در آن مغز استخوان در غالب مواقع به عنوان منبع تعداد نرمال HSC با قابلیت بازسازی طولانی مدت به حساب می آید. در مقابل، iPSC انسانی، به طور آشکار قابلیت استفاده برای رشد آزمایشگاهی HSC را ندارد. بنابراین، ایجاد HSC انسانی از ESC و iPSC می بایست از طریق تمایز در رشد آزمایشگاهی بافت ها مورد توجه قرار گیرد. موفق ترین روش جهت حاصل آوردن HSC تحت شرایط آزمایشگاهی از ESC انتقال سلول ها با HOXB4 می باشد [23، 25، 47 ـ 54].

با این وجود، در این نوع از رویه های اصلاحی رتروویروسی اقدام به ایجاد سلول هایی می شود که در آن توان خونسازی بر حسب سلول همچنان در مقایسه با تعداد سلول های مغز استخوان جدا نشده در سطح پایینی قرار دارند. به علاوه، سلول های انتقالی رتروویروسی خطر جهش را نیز در بردارند که ممکن است خود منجر به فرآیند تغییر شکل بدخیم، به طور مثال بروز سرطان خون در مورد HOXB4، شوند [55]. مطالعات اندکی فرآیند پیوند سلول های انتقالی غیر ـ HOXB4 را گزارش نموده اند که منجر به بزرگ شدن طویل المدت بخش های مختلف لنفاوی و بخش های شبه مغز استخوان شده است، اما هیچ کدام از آنها قابلیت بازسازی سلول های خونساز تحت شرایط انتقال ثانویه را نداشته اند [56 ـ 59]. این  سئوال همچنان باقی می ماند که کدام یک از سویه ها تحت چنین شرایطی قابل توسعه هستند.

جدول 1. تمایز خطوط IPSC حاصله از MBM و MEF در مقایسه با خطوط ESC. تعداد سلول ها مشخص کننده موارد توسعه یافته از سلول های غیرتمایزی 10³ × 4 (روز صفر) می باشند. سطوح بیان معرف مقدار mRNA مشخص شده از طریق RT-PCR کمی است که به بیان GAPDH نرمالیده گردیده و به عنوان مقادیر بیان ژن های مطبوع در سلول های Bruce4 ES غیرمتمایز محاسبه شده اند (روز صفر).

این موضوع نیز نشان داده شده است که نمونه های مربوط به کیسه زرده دورتا دور جنین نشان دهنده پتانسیل HSC حداقلی می باشد [60 ـ 62]. در مقابل، سلول های حاصله از پارا ـ آئورتیک ـ اسپلن چنوپلورا می توانند سبب بازسازی مغز استخوان HSC گردند که قابلیت ایجاد سلول های خونساز را نیز خواهند داشت [60، 61، 63]. به علاوه این موضوع نیز محتمل خواهد بود که تمایز ESC تحت شرایط آزمایشگاهی صرفاً قابلیت تولید HSC را داشته باشد که از توانایی اولیه برخوردار خواهد بود اما در عین حال از توان خونسازی قطعی بهره مند نمی باشد. چنین موردی عدم توانایی نمونه های خونساز حاصله از ـ ESC جهت ایجاد HSC با قابلیت رشد در سلول های لنفاوی در پی پیوند را توصیف می نماید. این احتمال این حقیقت را نادیده می انگارد که ESC و iPSC را می توان به صورت اولیه متمایز ساخت، یعنی بیان اریتروسیت های هموگلوبین نوع جنینی و سلول های قطعی که در حقیقت لینفسیدها تحت شرایط آزمایشگاهی می باشند. فرابیان HOXB4 در سلول های خونساز حاصل آمده از بخش جنینی ESC و کیسه جنینی قابلیت تشخیص HSC پیوندی را به وجود می آورد [47] (شکل 1). بنابراین HOXB4 به دو روش مدنظر خواهد بود. روش اول افزایش تعداد HSC قابل پیوند. و مورد دوم ایجاد HSC قابل پیوند از طریق اصلاح گیرنده های خانگی. بنابراین، تزریق سلول های خونساز از ESC انسان به طور مستقیم به مغز استخوان منجر به تشخیص HSC با قابلیت جمعیت پذیری مجدد خواهد شد [49]. در نتیجه، ما می بایست قابلیت درک برنامه مولکولی را داشته باشیم که در آن اقدام به القای این ویژگی با جزئیات بیشتر آن جهت شکل گیری HSC با ویژگی بازسازی طویل المدت با توجه به پتانسیل خونسازی قطعی، همانند HOXB4، اما بدون دخول رتروویروس، می شود.

در نهایت، سلول های غیرخونساز فراهم آورنده یک مؤلفه کلیدی در مغز استخوان برای تمایز مناسب آنها می باشند که البته هنوز می بایست آنها را مورد بررسی و تحقیق قرار داد و چنین مؤلفه ای تحت شرایط کشت ESC متمایز کننده نادیده انگاشته شده است. به علاوه، HSC با قابلیت جمعیت زایی مجدد طویل المدت که در داخل مغز استخوان قرار بگیرد نیز از جمله ویژگی های قابل توجه در یک حالت کاملاً ساکن (G₀) و مسایل بالقوه پیوند در طی گذار S/G₂/M آنها می باشد [64 ـ 67]. شرایط کشت جاری این بافت قابلیت تکثیر سلول های کاندید HSC را به وجود می آورد. توسعه شرایطی که به سلول ها اجازه ورود به داخل و تداوم زیست در فاز G₀/G₁ را می دهند جزء مؤلفه های دیگر مهمی می باشد که می بایست تحت شرایط آزمایشگاهی HSC آنها را در نظر گرفت.

4. نتیجه گیری

هر دوی مراحل توسعه آزمایشگاهی، در ابتدا، از سلول های تمایز یافته سوماتیک به iPSC و در وهله دوم از iPSC به HSC همچنان به صورت غیرکارآمد، حتی با استفاده از سلول های موش، می باشند و بنابراین استفاده بالینی از HSC انسانی حاصل آمده از سلول های سوماتیک بیماران همچنان بسیار از واقعیت فاصله دارد. چنین موردی به پیشرفت های بسیار زیادی در مراحل مختلف برنامه ریزی مجدد و تمایز سلول ها نیاز خواهد داشت (شکل 1). انواع مختلف سلول های سوماتیک معرف وضعیت های تمایزی متفاوتی هستند، که از قابلیت های رشد مختلفی در محیط آزمایشگاهی برخوردار بوده و همچنین از مؤلفه های مختلف در ارتباط با انتقال به وسیله بردارهای رتروویروسی و دیگر عوامل غیر مشخص نیز بهره مند می باشند که سبب می شوند تا قابلیت برنامه ریزی مجدد با توجه به کارآمدی های مختلف آنها مدنظر قرار گیرد. به منظور حاصل آوردن برنامه ریزی مجدد کارآمد برای HSC، روش های القایی معکوس یا غیرجامع برنامه ریزی مجدد را می بایست بکار گرفت، چرا که بیان بیش از حد ویژگی های ساختاری عوامل برنامه ریزی مجدد بر روی اعمال مؤلفه های تمایز تأثیرگذار خواهند بود. سلول های ES و تا اندازه کمتری HSC را می توان در کلیه انواع سویه های سلول های خونساز تحت شرایط آزمایشگاهی توسعه داد. با این وجود، تولید مجدد سلول های HSC با قابلیت پیوند تحت  شرایط آزمایشگاهی از سلول های پرتوان بدون فرا بیان HOXB4 همچنان به عنوان یک مورد چالش برانگیز به شمار می آید (شکل 1).